三维细胞培养系统其操作指南具体如下

　　三维细胞培养系统是一种通过构建三维空间结构，模拟细胞在体内自然微环境的体外培养技术，旨在弥补传统二维细胞培养与动物实验间的差距，为细胞提供更接近生理状态的生长条件。该系统核心在于通过支架材料或无支架技术构建三维结构。支架材料包括天然的胶原、Matrigel及合成材料如聚乳酸、聚苯乙烯等，它们通过调整孔隙率、力学性能支持细胞黏附、迁移及功能表达。无支架技术则包括悬滴法、磁力悬浮等，利用重力或磁场使细胞聚集成球。

　　三维细胞培养系统有多种类型，常见的包括基于基质胶、细胞外基质支架、微流控芯片以及旋转培养系统等，不同系统操作方法有所差异。以下是一些常见三维细胞培养系统的操作指南：

　　1、基于基质胶的三维细胞培养

　　实验材料准备：准备基质胶、适合细胞生长的培养基、细胞、24孔板或6孔板等实验耗材。

　　基质胶预处理：将基质胶从-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱过夜融化。然后根据实验需求，按一定比例与培养基混合稀释，如1:10。将稀释后的基质胶均匀铺在培养板孔中，每孔约200-300μL，轻轻晃动培养板使其覆盖孔底，再将培养板放入37℃、5%CO₂培养箱中孵育30-60分钟，使基质胶形成凝胶状基底。

　　细胞接种与培养：将处于对数生长期的细胞消化下来，用含血清培养基重悬制成单细胞悬液。使用细胞计数板计数，根据实验设计调整细胞密度，一般建议在5×10⁴-1×10⁵个/mL。将细胞悬液均匀接种到铺好基质胶的培养孔中，每孔约200-300μL，轻轻晃动培养板使细胞均匀分布，然后放入培养箱培养，定期更换培养基。

　　实验观察与分析：通过倒置显微镜观察细胞形态变化，记录生长、增殖情况。还可根据实验目的，采用MTT实验、划痕实验等方法对细胞功能进行检测，最后对实验数据进行统计分析。

　　2、基于细胞外基质（ECM）和Transwell系统的三维细胞培养

　　材料准备：准备Matrigel或其他ECM、预冷无菌1.5ml离心管、Transwell插入（24孔或12孔，根据细胞大小选择孔径）、适配多孔板、细胞系或类器官模型、培养基、无菌移液器与枪头、无菌PBS缓冲液等。

　　ECM预处理：将ECM悬浮液从冰箱取出保持在冰上，用预冷移液器移取适量分装到离心管中。然后将少量ECM加入到Transwell系统的下腔室底部，涂布均匀，放入37℃温箱孵育30分钟使其固化。

　　细胞或类器官悬液制备：胰酶消化细胞后重悬于培养基中，计数并调整浓度至1-5×10⁶cells/ml。若为类器官，先用ECM包被，再轻轻重悬至ECM中并调整浓度。

　　Transwell插入预处理：在每个Transwell插入的内腔中加入50-100μl的ECM，确保覆盖孔膜表面，孵育30分钟至固化。

　　细胞或类器官接种：将细胞悬液或类器官悬液滴加到Transwell插入的内腔中，然后向上腔室和下腔室加入合适的培养基，注意避免气泡产生。

　　培养与维护：将多孔板放入37℃、5%CO₂培养箱中培养，每隔2-3天更换上腔室和下腔室的培养基，更换时小心吸除旧培养基，避免扰动细胞或类器官。

　　分析与记录：定期用显微镜观察生长情况，记录图像和形态学变化。还可根据需求收集细胞或类器官，用于免疫荧光、qPCR等功能分析，同时记录培养情况和相关数据。

　　3、微重力3D旋转细胞培养系统

　　系统安装：将回旋主机放置在培养箱内，确保旋转座与培养箱内壁至少保留10cm间隙。使用配套扁平电缆连接控制器与主机，注意接口防尘。接入220V交流电。

　　参数设置：通过控制器触屏选择重力模式，如微重力（1-4rpm）或超重力（2-5g），还可设置定时启动、旋转速度梯度变化等程序。

　　培养容器准备：若为悬浮细胞培养，可使用T25培养瓶或转壁式EP管反应器，注意培养基充注量。进行3D球体培养时，优化细胞密度，如5×10³-1×10⁴cells/mL，添加低血清培养基。

　　系统启动与监测：启动系统后，通过重力传感器查看X/Y/Z轴重力数值，确保实验条件稳定。系统支持37°C、5%CO₂培养箱环境，需提前校准温湿度参数。

　　注意事项：控制器需远离强磁场环境，启动前确认旋转框无阻挡。定期用75%酒精擦拭旋转座表面，防止污染，且定期对重力传感器校准。

　　4、基于水凝胶的三维细胞培养（以CulXⅡ型为例）

　　材料准备：准备CulXⅡ型水凝胶冻干粉、细胞培养基、待培养细胞。

　　水凝胶制备：根据需要加入一定量的细胞培养基溶解冻干粉，如加入5ml培养基，使用平头移液枪头轻轻吹打至冻干粉充分分散，然后转移至无菌离心管中，涡旋30-60秒至完q溶解。随后4000转离心5分钟除去气泡。

　　细胞接种：将混合溶液加入沉淀的待培养细胞中重悬细胞，并调整到所需细胞浓度，对于类器官培养，推荐细胞密度为5×10⁵到1×10⁶左右。将得到的混合悬液接种到无TC处理的细胞培养板。

　　培养与换液：将培养板放入37°C二氧化碳培养箱中培养。换液时可采用回收重悬换液或半量换液两种方式。回收重悬换液即吸取培养体系，加入缓冲液或培养基稀释10倍，混匀后1500转离心5分钟，沉淀回收细胞，再用同样支架浓度的培养基悬浮细胞后加入培养容器。半量换液则是取出一半体积的培养体系，加入另一培养孔，再用同样支架浓度的培养液补满并吹打混匀。

　　细胞回收：吸取培养体系置于无菌离心管内，加入缓冲液或培养基稀释10倍，混匀后1500转离心5分钟，即可沉淀回收细胞。