荧光定量PCR仪是一种用于分子生物学检测的高灵敏度、高特异性的分析仪器。通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR(聚合酶链式反应)产物进行标记和跟踪,实时监测反应过程中的荧光信号变化。在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。随着反应循环数的增加,目标DNA的扩增会导致荧光信号的增强。通过检测荧光信号的变化,可以绘制出荧光强度相对于循环数的扩增曲线,从而实现对靶DNA的定量分析。
荧光定量PCR仪其主要特点:
一、准确性高
荧光信号强度与拷贝数相关
荧光定量PCR通过对荧光信号的精确检测来确定目标核酸的初始量。荧光信号强度与PCR反应体系中目标核酸的拷贝数成正比关系。在PCR反应的指数期,每一个循环的荧光信号增加量都与起始模板量直接相关。例如,在检测病毒核酸载量时,荧光信号强度能够准确反映病毒基因组的初始拷贝数,从而为病毒定量提供可靠的数据。
精密的温度控制
仪器具备高精度的温度控制系统,能够精确控制PCR反应的各个阶段(变性、退火、延伸)的温度。温度的准确性对于保证PCR反应的效率和特异性至关重要。例如,在人类基因检测中,精确的退火温度可以确保引物与模板的特异性结合,避免非特异性扩增,从而提高检测结果的准确性。
二、灵敏度高
低拷贝数检测能力
荧光定量PCR仪能够检测到极低拷贝数的目标核酸。它可以检测到单拷贝或几个拷贝的核酸分子,这对于微量核酸的检测非常重要。例如,在肿瘤研究中,可以检测血液中循环肿瘤细胞中的微量核酸标志物,有助于早期肿瘤诊断和病情监测。
荧光检测的高灵敏度
仪器采用高灵敏度的荧光检测技术,如荧光染料法或荧光探针法。荧光染料可以特异性地结合双链DNA,在PCR反应过程中,随着双链DNA的逐渐增加,荧光信号也逐渐增强。荧光探针则通过与目标核酸序列特异性结合并发出荧光信号,其检测灵敏度更高。例如,TaqMan探针技术可以检测到单分子水平的核酸靶标。
三、速度快
实时检测
荧光定量PCR仪能够在PCR反应过程中实时检测荧光信号,不需要像传统PCR那样在反应结束后进行电泳分析等后续步骤。这样可以大大缩短检测时间,一般整个检测过程可以在1-2小时内完成。例如,在食品微生物检测中,能够快速检测出食品中是否含有致病微生物。
高通量检测
许多荧光定量PCR仪可以同时处理多个样品,一次可以检测96个或更多样品。这种高通量的特性使得它在大规模检测任务中具有很大的优势,如在疾病筛查、药物研发等领域可以快速处理大量样本。
四、特异性强
引物和探针的特异性
通过使用特异性的引物和探针,荧光定量PCR仪可以精确地检测目标核酸序列。引物是根据目标核酸的特定区域设计的短DNA片段,只有在引物结合位点与模板完q匹配时才能引发PCR反应。探针则是基于目标序列设计的荧光标记的寡核苷酸,它与目标序列特异性结合并产生荧光信号。例如,在检测某种病原体的特定基因型时,特异性的引物和探针可以区分不同亚型的病原体。
减少非特异性扩增
仪器可以通过优化PCR反应条件(如温度、引物浓度等)来减少非特异性扩增。非特异性扩增会导致假阳性结果,影响检测的准确性。荧光定量PCR仪可以利用其高灵敏度和特异性的特点,结合熔解曲线分析等方法,识别和排除非特异性扩增产物。例如,在基因表达分析中,准确的检测结果依赖于特异性地检测目标基因的表达,而不是非特异性的背景信号。